Ацетатний агар застосовують для диференціації за здатністю ферментувати ацетат. Завдяки тому, що ацетат в складі середовища є єдиним джерелом вуглецю, ріст бактерій, не здатних до його утилізації, пригнічується. В свою чергу бактерії, які його ферментують, у процесі своєї життєдіяльності продукують лужні сполуки. Присутність останніх в середовищі змінює його забарвлення з зеленого на синій. Культивують зразки при 37°С, остаточний результат оцінюють через 72 години, хоча зазвичай вже через 24 години реакція вже проходить. Тривалість культивування залежить від штаму, який аналізують.